質粒小提試劑盒

（離心柱型）

貨號：DP001         規格：100T/200T      保存：室溫（RNase A -20℃保存）

產品說明：

本試劑盒采用堿裂解法裂解細胞，根據離心吸附柱在高鹽狀態下特異性結合溶液中DNA的原理特異性提取質粒DNA。離心吸附柱中采用的硅基質材料能高效、專一的吸附DNA，可最大限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取的質粒DNA可適用于各種常規操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉化等試驗。

產品組成：

儲存條件：

該試劑盒置于室溫（15-25℃）干燥條件下，可保存12個月。RNase A -20℃長期保存，2-8℃可穩定保存。若溶液產生沉淀，可在37℃水浴中預熱10min，以溶解沉淀。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2-8℃保存。單獨包裝的RNase A -20℃穩定保存12個月以上。

使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

操作步驟：

1. 取1-5mL細菌培養物，12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。

2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液Ⅰ（請先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或旋渦振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。

3. 向離心管中加入250μL溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免打斷細菌基因組DNA進而造成污染，此時菌液應變得清亮黏稠，作用時間不要超過5min，以免質粒受到破壞。

4. 向離心管中加入350μL溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min，用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后應立即混合，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5. 將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6. 向吸附柱中加入700μL漂洗液（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

7. 向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放回收集管。

8. 12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫放置數分鐘，目的是去除吸附柱中殘余的漂洗液，否則漂洗液中的乙醇會影響后續實驗，如酶切、PCR等。

9. 將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200μL經65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

10. 為了增加質粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。提取獲得的質粒DNA經濃度及純度檢測后于-20℃保存。

注意事項（在使用本試劑盒前請閱讀此注意事項）：

1. 使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現混濁，如有混濁現象，可經37℃水浴，待溶液恢復澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用時避免直接接觸，后應立即擰緊蓋子。

2. 洗脫緩沖液體積不應少于50μL，體積過小影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右（可用NaOH將水的pH值調至此范圍），pH值低于7.0會降低洗脫效率，提取產物應保存在-20℃，以防降解。

3. 如果所提質粒為低拷貝質?；虼笥?/span>10kb的大質粒，應加大菌體使用量，使用5-10mL過夜培養物，同時按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當地延長時間，以增加提取效率。

4. 濃度及純度檢測：得到的質粒DNA純度可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計進行檢測，其與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。DNA應在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當于大約50μg/mL雙鏈DNA、40μg/mL單鏈DNA。OD260/OD280比值應為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響吸光值，但并不表示純度低。

DP001三獅質粒小提試劑盒說明書2201-A.pdf