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    實時熒光定量PCR技術

    2022-09-17 17:02:22

    實時熒光定量PCR技術概念

    實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR),又名定量PCR,是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的方法。它通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析。

    實時熒光定量PCR儀

    實時熒光定量PCR是在PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術。

    實時熒光定量PCR技術原理

    它的原理是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,通過標準曲線對未知模板進行定量分析。

    實時熒光定量PCR技術優點

    a.可進行準確的定量檢測,實時性和準確性好;

    b.定量范圍寬;

    c.靈敏度高;

    d.特異性和可靠性更強,克服了假陽性;

    e.操作簡單快速,無 污染,無須后處理和電泳檢測;

    f.安 全,技術易于學習,易于進行電腦化數據管理;

    g.目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。

    PCR反應基本步驟

    a.變性:通過加熱使模板DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂,雙鏈分開而成單鏈的過程,高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈(94℃,30s)。

    b.退火:當溫度降低時,引物與模板DNA中互補區域結合成雜交分子,低溫下,引物與模板DNA互補區結合(55℃,30s)。

    c.延伸:在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下,DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸,合成出與模板DNA鏈互補的DNA子鏈,中溫延伸,DNA聚合酶催化以引物為起始點的DNA鏈延伸反應(70-72℃,30-60s)。

    以上述三個步驟為一個循環,每一循環的產物均可作為下一個循環的模板,經過n次循環后,目的DNA以2n的形式增加。


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